Esta enfermedad provoca una extensa defoliación prematura de la hoja que conduce a la pérdida de robustez del árbol y disminución de la producción de aceituna. La enfermedad se manifiesta por diferentes síntomas en el haz y envés de la hoja, así como en el fruto. En el haz de la hoja, las manchas cloróticas se vuelven marrones y necróticas con la progresión de la infección. El envés de la hoja muestra áreas típicas de color gris oscuro por las que recibe el nombre de “emplomado”. El fruto también puede ser infectado, mostrando manchas necróticas irregulares, hundidas, oscuras, causando una menor calidad del aceite de oliva debido a mayores niveles de acidez libre y peróxido. El periodo de incubación, así como la velocidad de crecimiento y propagación del hongo son desconocidas, pero probablemente se ven favorecidas por las condiciones ambientales.

La identificación de Pseudocercospora mediante PCR cuantitativa a tiempo real es un paso fundamental en el desarrollo de herramientas para la detección y el control de la enfermedad. Por este motivo iniciamos el proyecto de investigación “Desarrollo de qPCR para detección precoz y cuantificación de Pseudocercospora cladosporioides”, junto con la Unidad de inmunogenética del Departamento de Biología Experimental de la Universidad de Jaén, para el desarrollo de una técnica de detección rápida del fitopatógeno con el fin de poder realizar un diagnóstico precoz de la enfermedad, lo que supondrá una mejor gestión del cultivo afectado, implicando terapias sanitarias tempranas, incluso antes de que se aprecien los síntomas y el uso adecuado de los tratamientos fitosanitarios.

ESTUDIO “Desarrollo de qPCR para detección precoz y cuantificación de Pseudocercospora cladosporioides”

La práctica actual de diagnóstico de la cercosporiosis del olivo consiste en aislar el hongo basándose en características morfológicas del cultivo in vitro e identificarlo mediante la amplificación por PCR convencional de los espaciadores transcritos internos (ITS) más la secuenciación de ADN de Sanger, que permite una clasificación exacta de los aislados de campo y la comparación con otras especies de Pseudocercospora.

Este procedimiento requiere aislamiento de muestras visiblemente enfermas y consume mucho tiempo porque P. cladosporioides es un hongo de crecimiento lento que requiere hasta tres semanas de incubación para una biomasa suficiente para la extracción de ADN.

Sin embargo, la utilización de PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) que utiliza sondas de hibridación (TaqMan) supone un gran avance con respecto a la técnica anterior. Sus principales ventajas:

1. Cuantificación precisa y específica incluso con una carga patógena muy baja.

2. Control interno mediante coamplificación del ADN de la planta en una reacción multiplex.

3. Menor probabilidad de contaminación cruzada en comparación con PCR convencional (seguida de electroforesis).

Hasta donde sabemos, no hay una descripción previa del ensayo molecular para la detección y cuantificación de la Pseudocercospora en hojas de olivo. La falta de herramienta de diagnóstico rápido para P. cladosporioides en tejido asintomático limita la evaluación temprana para el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad.

Objetivos

El objetivo general de este trabajo es ofrecer una herramienta de diagnóstico rápido para evaluar la resistencia a la enfermedad del olivo, la detección precoz de la enfermedad antes de la manifestación de los síntomas y el seguimiento de la eficiencia de diferentes tratamientos antifúngicos. Para ello, desarrollamos los siguientes objetivos específicos:

1. Desarrollar ensayos específicos y sensibles de qPCR para detectar Pseudocercospora cladosporioides en tejido vegetal de olivo.

2. Utilizar los ensayos moleculares de qPCR para correlacionar la biomasa pcladosporioides en la hoja en diferentes etapas de progresión de la enfermedad.

Resultados

Análisis de curvas estándar y prueba de sensibilidad: existe una fuerte correlación entre el ciclo umbral (Ct) y la cantidad de ADN de P. cladosporioides (Figura 1A) mostrando que la PCR singleplex tiene una alta sensibilidad y especificidad al patógeno (r=0.995) (Figura 1B). En la PCR multiplex la sensibilidad se reduce, aunque mantiene un coeficiente de correlación de r=0.991.

Pruebas a ciegas: las pruebas a ciegas de la PCR multiplex mostraron una concordancia del 100% (Figura 2).

Correlación entre las etapas del desarrollo de los síntomas y la biomasa de cladosporioides: los valores medios de Ct obtenidos no coincidían con el nivel aparente de infección (Figura 3).